转录组测序(RNA-seq)
[!NOTE] 转录组(transcriptome) "A transcriptome is a collection of all the transcripts present in a given cell." (NHGRI factsheet, NIH, US)
- Basic RNA-seq processing: unix tools and IGV (http://bio.lundberg.gu.se/courses/vt13/rnaseq.html)
实验流程
RNA-seq建库流程
- RNA (light blue) is first extracted,提取所有的mRNA或total RNA
- DNA contamination is removed using DNase, 用DNase去除DNA(在RNA建库流程中,DNA被认为是污染物)
- 可选过程:去除rRNA/选择mRNA
- The remaining RNA is broken up into short fragments, 将RNA打断成短片段(二代测序读长问题)
- RNA fragments are then reverse transcribed into cDNA (yellow), 将RNA片段逆转录为cDNA
- 可选过程:链特异性选择
- Sequencing adaptors (blue) are ligated, 连接adapter
- 可选过程:PCR扩增
- fragment size selection is undertaken, 选择合适长度的cDNA
- The ends of cDNAs are sequenced using next generation sequencing technologies to produce many short reads, 进行测序
- 可选过程:单端测序或双端测序
参考文献:https://www.nature.com/articles/nrg3068
数据分析
经典的RNA-seq数据分析流程为先使用TopHat进行测序短序列映射后,再使用Cufflinks进行转录本的组装与丰度估计(图1)。
Overview of Cuffliniks [3]
- (a) The algorithm takes as input cDNA fragment sequences that have been aligned to the genome by software capable of producing spliced alignments, such as TopHat.
- (b-e) With paired-end RNA-Seq, Cufflinks treats each pair of fragment reads as a single alignment. The algorithm assembles overlapping 'bundles' of fragment alignments (b,c) separately, which reduces running time and memory use, because each bundle typically contains the fragments from no more than a few genes. Cufflinks the estimates the abundances of the assembled transcripts (d,e).
基因注释文件
GFF格式
gff全称为general feature format(通用特征格式)。GFF文件是一种用来描述基因组特征的纯文本文件,由9列数据组成,每一列代表序列的一个不同的特征。列是通过制表符分隔的。GFF文件有不同的版本,目前基本使用第三版(gff3)。 GFF文件的第一行包含一个文本标题##gff-version3。紧接着下面以#号开头的各行还可以包含描述性的文本,如文件、来源、版本号、注释、参考文献等。 在描述行之后,由9列数据组成,前8列在gff的各个版本中信息都是相同的,只是名称不同,第9列attributes的内容存在很大的版本特异性。
seqid source type start end score strand strand attributes
以gff3为例,这9列信息分别是:
- seqid:参考序列的id,如1号染色体
- source:生成此注释的来源。如果未知,则用点(.)代替。一般指明产生此gff3文件的软件或方法。
- type:序列类型,此处的名词是相对自由的,建议使用符合SO(sequenceontology)惯例的名称,如gene,repeat_region,exon,CDS等。
- start:开始位点,按照坐标系统表示,从1开始计数(区别于bed文件从0开始计数)。
- end:结束位点。
- score:得分,对于一些可以量化的属性,可以设置一个数值以表示程度的不同。如果为空,用点(.)代替。
- strand:“+”表示正链,“-”表示负链,“.”表示不需要指定正负链。
- phase:相位。对于编码蛋白质的CDS来说,本列指定下一个密码子开始的位置。可以是0、1或2,表示到达下一个密码子需要跳过的碱基个数。
- attributes:序列属性。一个包含众多属性的列表,格式为“标签=值”(tag=value),不同属性之间以分号相隔。每个标签是一个属性,并被赋予一个值,可以使用多个标签。
另外,在基因结构注释gff文件中,基因包含mRNA,mRNA包含exon, CDS, UTR等信息,同时在注释文件中除基因行外,其他行在第9列会通过Parent指明该行从属的上一级ID,也就是一个基因的gene行、mRNA行、CDS行、exon行都会通过Parent层层关联在一起。具体的描述可以在www.sequenceontology.org/gff3.shtml上查看GFF规范。
GTF和GFF格式文件
GFF(General Feature Format)格式是一种简单、方便地对DNA、RNA及蛋白质序列的特征进行描述的一种数据格式,已经成为序列注释的通用格式。当前广泛使用的GFF格式为第3版,即GFF3。 GTF(Gene Transfer Format)格式主要用于对基因进行注释的数据格式,当前广泛使用的GTF格式为第2版,即GTF2。 GFF与GTF这两种格式的文件可以相互转换,它们的前8列是相同的,第9列虽然都是记录标签与值配对的情况,但是两者有所不同,在GTF文件中标签与值之间以空格分隔,并且每个特征之后都带有分号“;”(包括最后一个特征)。
GTF2 | GFF3 | |
---|---|---|
特征类型 | 必须注明 | 可以任意名称 |
属性 | 标签和值以空格分隔 | 标签和值以"="分隔 |
GTF和GFF格式文件可以使用Cufflinks的工具gffread进行转换,代码如下:
#GFF文件转换成GTF
gffread my.gff3 -T -o my.gtf
#GTF文件转换成GFF文件
gffread merged.gtf -o- > merged.gff3
References
- Madlung, A. Assessing an Effective Undergraduate Module Teaching Applied Bioinformatics to Biology Students. PLOS Computational Biology 2018, 14 (1), e1005872. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005872.
- Trapnell, C.; Roberts, A.; Goff, L.; Pertea, G.; Kim, D.; Kelley, D. R.; Pimentel, H.; Salzberg, S. L.; Rinn, J. L.; Pachter, L. Differential Gene and Transcript Expression Analysis of RNA-Seq Experiments with TopHat and Cufflinks. Nature Protocols 2012, 7 (3), 562–578. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.016.
- Trapnell, C., Williams, B., Pertea, G. et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol 28, 511–515 (2010). https://doi.org/10.1038/nbt.1621
- Blaiseau, P.L., Holmes, A.M. Diauxic Inhibition: Jacques Monod's Ignored Work. J Hist Biol 54, 175–196 (2021). https://doi.org/10.1007/s10739-021-09639-4